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心得体会:组织样本的western blot,这十点需要注意
点击次数:36 发布时间:2018-10-19

   利用组织样本来进行Western blot,这是许多实验室常?沟墓ぷ。不过,若是想获得重复可靠的印迹结果,也绝非易事。在此,Bio-Rad的专家贡献了一些经验,可以帮助您获得清晰的图像和可靠的数据。

1. 快速处理组织

     使用干净的工具来收集和处理组织样本。为了去除可能影响蛋白稳定性的污染物,用预冷的中性缓冲液简单洗涤。洗涤后,在液氮中快速冷冻组织,以便保留蛋白的结构和特征,比如翻译后修饰(PTM)。组织样本可保存在冰上,立即匀浆处理。若保存在 –20°C,蛋白仍然有可能降解,因此组织样本要放在–80°C长期保存。

 

2. 精心挑选裂解液

     在选择最jia的裂解缓冲液时,应考虑pH值•●、离子强度•●、去污剂和变性剂类型等因素。放射免疫沉淀分析缓冲液(RIPA)是最广泛使用的裂解液。同时,在选择过程中也要考虑目标蛋白的定位,例如,细胞质蛋白建议选用Tris-HCl裂解液,而核蛋白则首xuan RIPA。在富集各个组分的低丰度蛋白时,可能需要对组织组分进行预先分离。裂解液的用量取决于组织的大小/重量;缓冲液与组织的比例对确保有效裂解很关键。

3. 选择破碎方法

      与细胞相比,组织需要更剧烈的破碎方法,如匀浆技术。为了进一步解离组织并剪切细胞DNA,可能需要对样本进行超声处理。这一步要避免起泡,因为它会降低回收率。同时,脂质会影响western blot的质量,要尽量去除。从植物组织中提取蛋白也颇具挑战性,因为它们富含蛋白酶,还含有大量可能干扰蛋白提取的代谢物。您必须针对特定的植物组织来优化提取过程。

4. 抑制蛋白降解

      细胞膜的破坏会释放出可降解蛋白质的酶。为了限制蛋白酶的活性,可以向缓冲液中加入尿素等强变性剂,不过这些条件可能会影响某些蛋白质的完整性,因此,裂解液中通常含有蛋白酶抑制剂混合物。常用的蛋白酶抑制剂包括PMSF•●、抑肽酶•●、亮抑酶肽和胃蛋白酶抑制剂。

       SUMO化蛋白的鉴定可能特别有难度,因为去除SUMO的异肽酶存在,并且通常只有一小部分蛋白被SUMO化。为了保留SUMO化,建议在裂解液中加入异肽酶抑制剂。去泛素化酶(DUB)的存在也会去除泛素结合物。因此,必须向细胞裂解液中加入EDTA或EGTA,以及dian乙酰胺(IAA)或N-乙基马来酰亚胺(NEM)。IAA和NEM的使用浓度通常为5-10 mM。不过,某些蛋白可能需要更高的浓度,比如IRAK1。

5. 定量您的样本

      测定样本浓度,可确保每块凝胶的上样量相同,并方便比较各个样本之间的蛋白水平差异,比如处理和未处理样本,或实验各个阶段的样本。您可以采用Bradford分析来进行总蛋白的标准化。不过,如果样本中包含不可溶和可溶蛋白,则Bradford方法不可靠,再次强调了均质化的重要性。

6. 选择最hao的凝胶

      最hao是根据目标蛋白的分子量来选择聚丙烯酰胺的百分比。例如,高分子量蛋白选择低的百分比,而低分子量蛋白选择高的百分比。如果您希望检测单个蛋白质,选择非梯度胶。如果是检测一系列不同大小的蛋白,则建议选择梯度胶。电压太高,可能会引起“微笑”条带。为了避免这种情况,建议在冷库中跑胶,并使用预冷的缓冲液。

7. 验证蛋白上样

     根据您的蛋白在细胞中处于哪个位置,可选择最jia的上样对照。对于细胞质中的蛋白,常用的对照是看家蛋白β-肌动蛋白或β-微管蛋白;对于核蛋白,通常使用组蛋白H1或组蛋白H3。不过,近年来许多研究表明最常用的看家蛋白不适合蛋白的归一化,强调生理和病理因素可能影响它们的表达水平。另一个问题是看家蛋白往往超出了检测的动态范围。

      Bio-Rad的免染(stain-free)成像技术则是一种很好的替代。这种技术利用总蛋白来进行归一化,有助于消除实验误差,得到更可靠的结果。它无需染色,利用掺入凝胶的三卤化合物,让蛋白质在光活化时发出荧光。与丽春红染色相比,免染技术扩大了线性检测的范围,并降低了实验的可变性。此外,转印后也无需染色,非常方便。

8. 选择合适的膜

     蛋白质可转印到硝酸纤维素(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜的机械强度更高,特别适合膜的剥离和再次结合。PVDF膜是疏水性的,需要在甲醇中预浸泡。NC膜的信噪比高,不需要甲醇预处理。需要注意的是,NC膜不能与含有SDS的转移缓冲液一起使用。在选择转印膜时,您可能还需要考虑其他参数,比如孔径。

9. 降低内源背景

     在对组织裂解物进行western blot检测时,内源IgG的信号和非特异性二抗结合可能会掩盖低丰度的蛋白或某种分子量的蛋白。~50 kD和~25 kD的蛋白尤其需要注意,它们可能被变性IgG的重链和轻链所掩盖。对于胸腺或甲状腺等组织,这个问题尤为明显,因为它们含有大量的内源IgG。

TidyBlot Western Blot检测试剂仅仅结合完整结构的非变性IgG,不会受样本中存在的IgG干扰。它可以直接代替传统二抗使用,为组织样本的检测带来清晰的背景。

10. 采用适当的对照

      为了确保一抗的特异性,必须使用阳性和阴性的组织对照。对于阳性对照,使用已知表达高水平目标蛋白的组织。推荐的阴性对照包括仅使用二抗(省略一抗孵育步骤)以及已知不表达目标蛋白的组织样本。此外,疾病状态下特定蛋白质的表达也会出现差异。为了解释这些差异,最hao使用健康组织和疾病组织的样本。

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