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远慕生物:细胞增殖与细胞周期
点击次数:34 发布时间:2019-06-03

      细胞增殖(Cell proliferation)是细胞生命活动的重要特征之一。细胞增殖最直观的表现是细胞分裂(cell division),即由原来的一个亲代细胞(mother cell)变为两个子代细胞(daughter cell),使细胞的数量增加。各种细胞在分裂之前,还必须经过一定的物质准备。物质准备和细胞分裂是一个高度受控的相互连续的过程。这一相互连续的过程即为细胞增殖。新形成的子代细胞再经过物质准备和细胞分裂,又会产生下一代的子细胞。这样周而复始,使细胞的数量不断增加。因而,细胞增殖过程也称为细胞周期(cell cycle)。

      目前在人体中已经发现25种周期蛋白。这些周期蛋白在细胞周期内表达的时相有所不同,所执行的功能也多种多样。各种周期蛋白之间有着共同的分子结构特点,它们均含有一段相当保守的氨基酸序列,成为周期蛋白框(cyclin box),介导周期蛋白与CDK结合。

图1:部分周期蛋白分子结构特征

细胞计数法

图:2:细胞计数法

细胞直接计数法是检测细胞增殖的方法之一,简单易操作,也非常公认,只是耗费时间长,所需细胞量多。无法区分增殖细胞和非增殖细胞,但是可在此基础绘制细胞生长曲线。

MTT法

MTT商品名为噻唑兰,是淡黄色的底物,可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(SDH)还原为水不溶性的蓝紫色结晶Formazan并沉积在细胞中。而刚死亡的细胞则不能剪切足够的MTT。

特定溶剂(如DMSO)能溶解细胞中的Formazan,用酶标仪在570nm测定其光吸收值。在一定细胞数范围内,Formazan结晶形成的量与细胞数成正比。此法相较于其他方法更加直观,操作简单。

CCK-8法

图3:WST-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent,即电子耦合试剂)

目前比较常用的还有CCK-8法,CCK-8是一种类似于MTT的化合物,是MTT的升级替代产品。在电子耦合试剂(EC)存在的情况下,活细胞线粒体中的SDH能使外源性WST-8还原为水溶性的橙黄色Formazan溶液,而死细胞无此功能。

BrdU/EdU掺入法

图4:BrdU法和BeyoClick™ EdU法检测原理的比较

公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中DNA的合成。

最初广泛使用的通过检测DNA合成来检测细胞增殖的方法是放射性标记核苷掺入法,如氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷([3H]thymidine)掺入法。但该方法由于有放射性污染并且很难实现单细胞检测而受到很大的限制,随后逐渐被基于抗体检测的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU(DNA前体胸腺嘧啶的类似物)可代替胸腺嘧啶掺和到DNA合成期(S期),而后利用抗Brdu单克隆抗体,未变性的双链DNA可用PI染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。但是由于BrdU法步骤繁多,且需要使用BrdU抗体,影响因素较多,稳定性比较差。EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine),中文名为5-乙炔基-2' -脱氧尿苷,是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷,thymidine)类似物,EdU可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。

图5:BeyoClick™ EdU检测法中的点击反应(Click reaction)原理图

另一方面,EdU上的乙炔基能与生物素标记的叠氮化物(Biotin labeled azide)通过一价铜离子的催化发生共价反应,形成稳定的三唑环,该反应非常迅速,被称作点击反应(Click reaction)。EdU法基于EdU掺入和后续的点击反应,无需使用抗体•●、操作便捷•●、检测灵敏度高,是一种在BrdU法基础上升级换代的新方法。

化学发光法

图6:化学发光法检测ATP的原理图

ATP作为最重要的能量分子,是细胞新陈代谢的一个重要指标,也是具有代谢活性细胞的重要标志性分子,并和活细胞数目成良好的线性关系。因此,ATP含量能很好地反应活细胞的数目,并且,ATP法简单•●、快捷且灵敏,非常适合高通量研究,是许多药物筛选实验的首xuan。

该方法最大的优点在于检测灵敏度特别高,可以检测到低至约12个细胞,并且检测速度非?(约十分钟就可完成一个96孔板的检测),特别适合用于高通量检测。CTL和CTL Plus两者相比,CTL Plus的检测上限更高,线性范围更宽,并且发光值随时间的稳定性也更高一些。经费非常充裕时推荐使用CTL Plus,但CTL在96孔板中单孔的细胞数量不超过3万时也能满足常规的高通量检测需要。

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