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shRNA 干扰实验,你目前在哪一步?
点击次数:7638 发布时间:2018-09-25

相信屏幕前的你,可能被 shRNA 干扰实验困扰了无数个日日夜夜......
亦或是屡屡想尝试,却次次与之失之交臂......
......被困扰的你是跪在哪一步了呢?
......而止步于起点的你又是因为什么呢?


今天写作这篇文章的目的呢,正是为帮助做实验的你缕清思路。让在干扰实验门口「探头」的你,系统的了解整个流程,从而让入门不再只是想象。

下面我要开始放大招了:

(一)shRNA 干扰机制&shRNA 设计

shRNA(short/ small hairpin RNA)干扰机制图解



 

shRNA 组成:

shRNA 包括两个短的反向互补序列,中间由茎环(loop)序列分隔,组成发夹结构,随后连上 5~6 个 T(转录终止信号)

手动设计,原则:

A. 首先靶位点选择应该避开基因的非编码区;

B. 在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T,这可能导致 shRNA 转录的提前终止;

C. Stratagene 发现 29 个寡核苷酸抑制目的基因表达的效率比 23 个寡核苷酸的高;

D. 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C,使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生;

E. shRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保 RNA 聚合酶转录。如果选择的目的序列不以 G 开头,必须在紧连正义链的上游加一个 G;

F. shRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央,比较了众多不同长度和序列的茎环,5'TTCAAGAGA3' 序列zui为有效;

G.  5~6 个 T 必须放置在 shRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶III终止转录;

shRNA 设计好并合成之后,通过同源重组或者是酶切连接的方法进行干扰载体构建,构建成功后大量抽提质粒(去内毒素且 OD260/OD280 最hao在 1.8 左右),以备转染。

 

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